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Digital PCR workflow影響檢測性能的各因素分析

更新時間:2022-09-08  |  點擊率:1025

轉(zhuǎn)自:羅氏診斷生命科學公眾號

小羅:大家好,本堂課小羅將帶領大家繼續(xù)學習數(shù)字PCR,分析一下Digital PCR workflow影響檢測性能的各因素。


基于泊松分布將核酸樣本分散到大量微孔或者液滴中(如圖1),相較于qPCR而言,dPCR無需標準曲線(如圖2),抑制成分被有效稀釋(如圖3),讀取結(jié)果方式具備更精確結(jié)果的潛力。盡管有諸多優(yōu)勢,我們?nèi)孕柚匾昫PCR的操作過程、試劑耗材穩(wěn)定性及硬件性能帶來的影響;同時需針對性的完善實驗細節(jié),從而盡可能減少引入的偏差,獲得高靈敏度、高穩(wěn)定性的實驗結(jié)果。


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圖1.dPCR實驗原理圖例

(來源:羅氏診斷整理)


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圖2.無需依靠通過標準品繪制的標準曲線

(來源:羅氏診斷整理)


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圖3.將樣本分散到微孔后可以降低體系抑制成分的抑制效果

(來源:羅氏診斷整理)


完整的數(shù)字PCR操作流程:

取樣過程:

a.

絕大多數(shù)生物學實驗在取樣過程中會引入取樣偏差,因此在此操作過程中應盡量保持取得樣本的操作一致,并且在不提高抑制物濃度的條件下,應盡量增大取樣體積,選取低吸附樣本管的耗材。


針對樣本本身,如果是全基因組核酸進行數(shù)字PCR研究則需要進行片段化處理。細菌,病毒等樣本通常需要結(jié)合多重靶標檢測,實驗設計時需分析靶點序列在基因組上的物理距離,并針對性的設計靶點引物或酶切干預來減少后續(xù)結(jié)果中出現(xiàn)的多靶標連鎖問題。


體系配置:

b.

此步驟主要涉及移液偏差。dPCR儀器移液步驟越多,誤差越大,因此在此操作過程中盡可能減少移液次數(shù),同時選擇校準過的靠近量程的移液器結(jié)合合適的低吸附槍頭(如圖4)。


移液操作通常為反向移液,對于低濃度樣本盡可能增加重復以防止低分子隨機性因素導致結(jié)果不穩(wěn)定,高濃度探針引物稀釋后移液可以減少批間誤差。以手動單道移液器為例(如圖5),同樣是移取20 μl液體,選擇量程是20 μl的移液器時精度≤±0.8%,換算成體積為±0.16μl;而選擇量程是200μ的移液器時精度為≤±6%,體積偏差在±1.2μl 。

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圖4.dPCR加樣時吸頭角度

(來源:羅氏診斷整理)


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圖5.針對不同量程移液器移液過程的誤差數(shù)據(jù)

(來源:羅氏診斷整理)


分散過程:

c.

有效反應單元數(shù)量是影響結(jié)果準確性和精確性的重要因素(如圖6)。以泊松分布為基礎來測算核酸濃度,需要在精度和動態(tài)范圍之間取得平衡。相同反應單元下,精度要求越高,動態(tài)范圍越小,精度要求越小,動態(tài)范圍越大,因此提高有效反應單元數(shù)量,可同時提高精度和動態(tài)范圍。

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圖6.20k,28k,100k微孔數(shù)目下,芯片孔越多,計算核酸濃度的準確性越高

(來源:羅氏診斷整理)


在反應單元一致的前提下,樣本體積越大,越有利于低拷貝基因的檢測。


分散過程中的誤差分析:統(tǒng)計學樣本濃度均值λ,即平均一個分區(qū)單元包含λ個拷貝不一定剛好是真實模板濃度,需要結(jié)合置信區(qū)間和置信水平表示,數(shù)字PCR中置信水平通常是95%,而針對置信區(qū)間科研和商業(yè)化公司有多種計算方式。


???絕對定量誤差分析,見圖例CI區(qū)間(如圖7)。

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圖7.dPCR絕對定量結(jié)果CI統(tǒng)計區(qū)間

(來源:羅氏診斷整理)


???CNV誤差分析更為復雜,需要目標基因和內(nèi)參基因濃度比ratio值及相應的聯(lián)合置信區(qū)間進行表示,見圖例CI區(qū)間(如圖8)。

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圖8.dPCRCNV結(jié)果CI統(tǒng)計區(qū)間

(來源:羅氏診斷整理)


信號采集:

d.

信號采集過程中熒光粉塵、交叉污染,都會影響正常陰陽單元的判定,可通過在超凈臺操作有效降低前者的影響。后者往往對反應單元的信噪比和單元間隔絕性有比較高的要求(如圖9),原理上微滴法很難控制微滴間干擾和液滴融合等問題,相較而言以芯片為反應單元的數(shù)字PCR設備可以通過提高微孔工藝進而解決此類問題。

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圖9.孔之間應有較大間隔,可以避開孔之間的交叉干擾,獲取更好的信噪比

(來源:羅氏診斷整理)


1D,2D結(jié)果中閾值的判讀也是影響最終結(jié)果的重要因素。由于試劑耗材組分、非特異性擴增、探針引物二聚體等現(xiàn)象,導致背景噪音更為明顯,導致陰陽性孔間閾值難以劃分(如圖10)。優(yōu)化探針引物序列和配比、摸索合適的退火溫度、配合低背景芯片耗材(如圖11),同時結(jié)合硬件,比如結(jié)合使用高分辨率的光學檢測系統(tǒng)、高性能的PCR溫控系統(tǒng)可以有效提高信噪比,使閾值能夠準確劃分。

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圖10.1D圖陰性(藍色)與陽性(紅色)信號應考察聚集度、信噪比、有無Rain等指標

(來源:羅氏診斷整理)


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圖11.芯片標準化的六邊形微腔

(來源:羅氏診斷整理)


以上就是數(shù)字PCR實驗流程常見的幾類問題和參考性的解決方案。我們在實驗中面對小分子樣本的隨機性,雖然無法超越不確定性極限達到確定,但通過細節(jié)把控和數(shù)據(jù)優(yōu)化,使我們可以通過高效的方案進行實驗。

*MC-CN-02168 有效期至2025年5月16日

活動最終解釋權歸羅氏診斷生命科學所有。





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